RogerKurlander
GeraldineP.Schechter
叶向军龚旭波译卢兴国审校
五、评估营养性和低增生性贫血的血清试验
1.血清铁和总铁结合力检测
血清铁是用自动化学分析测定从转铁蛋白中分离出的铁[19,20]。总铁结合力（TIBC）主要是因为与转铁蛋白的结合，通常通过样本中加入过量的铁来测量。通过吸收去除未结合的铁，而与蛋白结合的铁重新解离然后测定血清铁。在一些实验室，可直接测量不饱和铁结合力或转铁蛋白水平。在含血红蛋白（溶血标本）标本以及输血后许多小时内血清铁测量可假性升高。转铁蛋白饱和度百分比的计算是血清铁除以总铁结合力，然后再乘以。铁缺乏伴有低血清铁和高血清总铁结合力，因而转铁蛋白饱和度低。虽然炎症或慢性病性贫血患者的总铁结合力下降，在严重慢性炎症或慢性疾病以及在缺铁性贫血患中血清铁水平与转铁蛋白饱和度经常重叠。在简单的缺铁性贫血患者中高TIBC（μg/dL）在区分这两种疾病中有帮助，但是，当它们并存时TIBC常常下降（后述的铁蛋白和转铁蛋白受体检测）。许多病理可出现血清铁水平升高，如溶血、巨幼细胞和铁粒幼细胞性贫血、纯红细胞再生障碍性贫血、遗传性血色病引起的铁超负荷、输血性含铁血黄素沉着症、慢性肝病和慢性酒精中毒。给予摄入mg片剂或硫酸亚铁口服液1~2小时后血清铁上升至正常范围，提示良好的生物利用度和正常的小肠吸收能力[21]。
2.可溶性转铁蛋白受体
组织转铁蛋白受体的截短形式，可溶性转铁蛋白受体是通过“夹层式”酶联免疫法测定的。在红细胞生成增加状态，如溶血性贫血、巨幼细胞性贫血、地中海贫血以及缺铁性贫血，血清转铁蛋白受体水平升高。在再生障碍性贫血和肾功能不全等红细胞生成减少的时候，转铁蛋白受体水平下降。据报告该分析可以区别铁缺乏与慢性炎症病性贫血[22,23]，但常见这两者间的受体水平部分重叠。血清转铁蛋白受体水平与铁蛋白水平或铁蛋白水平对数的比例，在这两种疾病之间的鉴别上可能更有帮助[22]。见于一些炎症贫血患者的转铁蛋白受体水平升高很可能反映红细胞生成对功能性铁池的利用受限，而不是储存铁耗尽[24,25]。据报道，在预测铁缺乏中自动免疫比浊法优于两种常用的酶联免疫方法[26]。如前所述，网织红细胞血红蛋白含量改变是一种直接测量新红细胞血红蛋白化的方法，在红细胞生成活跃期间可能也是测量功能性铁利用最动态和敏感的方法。
3.血清铁蛋白
在临床上铁蛋白检测最有用的是：低值（20ng/mL）反映储存铁耗尽，和显著高值可能表明由遗传性血色病、肝病或输血性含铁血黄素沉着症引起的铁超负荷状态。由于铁蛋白是一种急性期反应物，在严重的炎症状态（如播散性真菌病）以及铁超负荷时可见ng/ml的极高水平。在炎症或肝病情况下铁缺乏患者的血清铁蛋白水平往往在正常范围内，一般不超过ng/ml[23]。在输血性含铁血黄素沉着症患者中存在炎症或肝病时，铁蛋白水平可能无法准确衡量铁螯合治疗的反应。
4.血清维生素B12（钴胺素）
血清维生素B12一般通过酶联竞争结合分析检测最常用的是结合至内因子[19,20]。血清B12水平低于pg/ml几乎总是与细胞维生素B12缺乏相关，可通过血清甲基丙二酸水平升高反映出来（见下述）[27]。50％的维生素B12水平在~pg/ml的患者和高达10％的~pg/ml之间的患者甲基丙二酸水平升高表明细胞缺乏维生素B12。高于pg/ml者只有0.1％有组织维生素B12缺乏。低维生素B12水平而无组织缺乏证据的患者大概表明维生素B12储存耗尽早期或结合蛋白运钴胺素蛋白I（血浆中主要的钴胺素结合蛋白）水平降低。在生产运钴胺素蛋白Ⅰ的主要细胞髓细胞严重枯竭的临床情况下，如再生障碍性贫血可能导致低血清维生素B12水平。骨髓瘤和人类免疫缺陷病毒（HIV）感染患者的维生素B12水平经常出现无法解释的降低，这也可能反映了髓细胞量的减少。肝坏死患者在肠外维生素B12治疗后，或者骨髓增殖性肿瘤（特别是慢性粒细胞白血病）相关B12结合蛋白增加者，都可出现血清维生素B12水平升高。
5.血清甲基丙二酸
甲基丙二酰脱氢酶是一种维生素B12依赖酶，在哺乳动物细胞中将甲基丙二酸盐转化为琥珀酸盐时需要此酶。可用气液色谱法或质谱法测定甲基丙二酸[20]。细胞维生素B12缺乏症患者中，95％以上血清和尿液中甲基丙二酸升高。有些患者血清维生素B12低而血清甲基丙二酸水平正常，这大概是储存耗尽而无明显的维生素B12缺乏。肾功能不全时，甲基丙二酸排泄减少会导致血清水平升高，而细胞中维生素B12并不缺乏。细胞维生素B12缺乏症的诊断可以通过开始维生素B12治疗后显示血清甲基丙二酸水平下降来证实。
6.血清同型半胱氨酸
维生素B12或叶酸缺乏阻碍了同型半胱氨酸甲基化形成蛋氨酸，并导致血清同型半胱氨酸的水平升高，这可以通过离子交换色谱法测量[20]。细胞维生素B12缺乏症通常会导致甲基丙二酸和血清同型半胱氨酸水平同时升高，但有5％的维生素B12缺乏患者仅为血清同型半胱氨酸升高。实践中，用同型半胱氨酸来证实细胞维生素B12或叶酸缺乏是不划算的。事实上，同型半胱氨酸水平更常用于动脉或静脉高凝状态的临床评估（见第22章）。同型半胱氨酸水平升高的其他原因包括肾功能不全以及叶酸循环和含硫氨基酸代谢所需的酶的遗传异常。
7.血清内因子抗体检测
该检查阳性对于自身免疫性内因子耗尽引起维生素B12吸收不良（恶性贫血）的诊断有高度特异性，但血清检测灵敏度50％。
8.血清和红细胞叶酸检测
通过竞争性受体结合分析法可测量叶酸水平[20]。血清叶酸水平反映最近的膳食摄入量，而红细胞叶酸水平反映红细胞形成时的体内叶酸储存。由于细胞摄取叶酸时需要维生素B12，维生素B12或叶酸缺乏均可见红细胞内叶酸水平降低。因此，红细胞叶酸水平降低时必须说明血清维生素B12水平。红细胞叶酸是由全血溶血产物来测量的，故血清叶酸水平升高可能会影响红细胞叶酸值。血清叶酸升高见于维生素B12缺乏和叶酸治疗之后。用血清和红细胞叶酸检测来评估叶酸缺乏也是不划算的，因为叶酸缺乏很容易治疗。以前在营养缺乏的个体中常见叶酸缺乏，在面粉制成的产品中添加叶酸已使美国很少发生叶酸缺乏症。不过，维生素B12的水平在假定为叶酸缺乏患者的评估中至关重要，原因为补充叶酸可以改善贫血，但不可能改善不可逆转的维生素B12缺乏所致的神经系统症状。
9.血清红细胞生成素
在难治性贫血患者中，骨髓衰竭而红细胞生成素水平显著升高（0U/ml），通常预示重组红细胞生成素治疗将无效。因此，免疫测定红细胞生成素对于确定红细胞生成刺激剂治疗不太可能有效的一组患者是非常有用的。另一方面，肾功能不全、恶性肿瘤或炎症性贫血患者中不值得检测红细胞生成素水平，因为这些情况下红细胞生成素水平总是降低（U/ml）。低水平的红细胞生成素检测对区分真性红细胞增多症与其他原因造成的红细胞增多是有意义的。真性红细胞增多症患者低于正常值范围提示自律性红细胞增殖。继发性红细胞增多患者的红细胞生成素水平或可升高，但常常在正常范围内，放血治疗后则可升高。
六、评估异常血红蛋白和溶血性贫血的检查
1.血红蛋白电泳
用于区分和定量异常血红蛋白和未成年人血红蛋白的方法包括，醋酸纤维素膜碱性电泳、酸性枸橼酸琼脂糖凝胶电泳、等电聚焦（IEF）电泳和高效液相色谱法（HPLC）[28]。临床实验室传统上用pH8.6的醋酸纤维素或琼脂糖凝胶电泳用以筛查和鉴定常见的血红蛋白A、S和C。当检出异常血红蛋白时，使用光密度扫描仪定量（图27-1）。用这种方法也可以分离未成年人HbF及HbA2；不过在成人中光密度扫描仪不能准确测量其中的含量。因为许多普通的血红蛋白G和D与HbS共移，常规使用可溶性试验以证实HbS的存在（见下述）。酸性枸橼酸琼脂电泳（也可分离血红蛋白A、S、C和F）常规用于二次确认，因为它（不像pH8.6的电泳）可以分辨HbD（含突变的β珠蛋白链）和HbG（含突变α珠蛋白链）与HbS。枸橼酸琼脂电泳还可以将HbC从HbE和HbOArab中分离，不同于碱性电泳中的HbC共移。
图27-1pH8.6的醋酸纤维素血红蛋白电泳
碱性电泳不能用于新生儿筛查，因为它不能清楚地分离HbA与HbF。IEF和HPLC被用于新生儿筛查，因为它们对不典型变异血红蛋白的筛查能力强于醋酸纤维素或酸性琼脂电泳。但是这些方法更加昂贵并且需要更多的专门知识来解释。
2.镰状可溶性试验
在浓缩磷酸盐缓冲液中脱氧HbS的不溶性可以用来确认某个具有适当电泳迁移率的血红蛋白，即HbS。由于可溶性试验无法区分镰状细胞特征和镰状细胞病，在临床上它不能用于诊断镰状细胞病。
3.镰状细胞病筛选实验（Prep）
镰状细胞特征或纯合子HbS个体的红细胞在脱氧时会形成镰刀形。在证实HbS存在时，该试验已被镰状细胞可溶性试验取代。此法也不能区分镰状细胞病与镰状细胞特征。
4.HbA2定量
HPLC是测量HbA2的首选方法[28]。柱层析也经常使用，但是在出现HbS时不可靠。HbA2水平升高3.5％时，通常证实β地中海贫血特征的诊断；临床医师应注意，缺铁会降低HbA2水平。α地中海贫血特征患者HbA2的水平正常。
5.HbF定量
许多临床实验室继续使用碱变性试验来定量HbF百分比。此试验原理是在碱性条件下其他大多数血红蛋白被沉淀而HbF仍保持可溶性。碱处理后，剩余HbF可通过过滤分离和分光光度计定量。该法能准确测定含有高达10％~15％HbF的标本，但更高水平时往往会被低估，此时基于HPLC方法更加准确。
6.HbF细胞
也可以用免疫学方法测定HbF以确定红细胞内HbF数量并区分含高水平HbF的红细胞（“F细胞”）与含低水平HbF的细胞（见第4章）。
7.不稳定血红蛋白试验
HbZurich和HbKoln等不稳定血红蛋白可通过溶血产物暴露在热（50℃）或17％异丙醇中发生沉淀来确认。不稳定血红蛋白还可以通过完整红细胞暴露在氧化环境后形成Heinz小体来检测（变性血红蛋白）。这些紫色包含物位于红细胞膜附近，红细胞与煌焦油蓝或新亚甲基蓝等活体染色剂孵育后可用显微镜检查（见第三章）。
8.葡萄糖-6-磷酸脱氢酶
在临床实验室，定性和定量检查可以用来发现G6PD缺乏。这些试验依赖于从NADP生成NADPH。最常见的筛查试验是荧光斑点试验，它依赖于NADPH的内荧光。在美国，最常见的G6PD缺乏症变异型个体（G6PDA-）的网织红细胞比成熟红细胞酶的数量要高得多。在A-型缺乏者中，如果由于氧化剂或药物产生溶血而发生网织红细胞反应性增多时，G6PD缺乏可被漏检。这一方法也可检出Heinz小体（如前述的变性血红蛋白）；另一方面也可能无法查出杂合子女性[29]。
9.血清结合珠蛋白
可通过比浊法或浊度法检测这种血红蛋白结合蛋白。结合珠蛋白是一种急性期反应物，但其主要意义是当水平非常低时用以提示急性或慢性溶血的诊断。游离血红蛋白与结合珠蛋白结合后30分钟之内被网状内皮系统清除。少至50ml红细胞的体内溶血会消耗掉血液中的结合珠蛋白。在无继续溶血的情况下，至少需要5天才能恢复到正常水平。因为α链的遗传差异，其正常范围变化很大。极少患者在遗传基础上有非常低的结合珠蛋白水平。严重肝病患者可能因肝脏合成影响而使结合珠蛋白减少。
10.尿含铁血黄素
在阵发性睡眠性血红蛋白尿或心脏瓣膜溶血等慢性血管内溶血患者中，肾脏排泄血红蛋白时被摄入血红素并随后以含铁血黄素形式积聚在肾小管细胞内。尿沉渣中含铁血黄素经普鲁士蓝染色后，镜下评估尿沉渣将显示蓝色的肾小管上皮，提示肾小管细胞中的铁沉积。
七、止血和凝血检查
1.活化部分凝血活酶时间
该检查是测定枸橼酸盐抗凝血浆与与钙，部分凝血活酶（缺乏组织因子的一种脂质源）和表面激活剂孵育后开始凝血所需的时间。自动化仪器以机械或浊度变化为基础检测凝血开始。活化部分凝血活酶时间（APTT）对因子Ⅷ和Ⅸ缺乏特别敏感，但因子Ⅻ、Ⅺ、Ⅹ、Ⅴ、Ⅱ和纤维蛋白原缺乏也会引起延长。因子Ⅷ轻度减少（大于30％~50％）和纤维蛋白原轻度减少（mg）用该法可能无法检测出[30]。抗凝剂（肝素、水蛭素、阿加曲班、比伐卢定、美拉加群等抗凝血酶），因子特异性抗体（最常见抗因子Ⅷ）和狼疮抗凝物可使APTT延长。1:1混合血浆（50％患者血浆和50％正常人血浆混合）APTT仍旧延长提示存在抗体。抗因子Ⅷ抗体的检测可能需要在37℃下与正常人血浆1:1混合后孵育1小时，使抗体结合因子Ⅷ。延长的APTT可被添加磷脂所纠正证实狼疮性抗凝物的存在。
用APTT监测普通肝素治疗以避免低于或高于治疗水平的剂量。虽然许多可用的部分凝血活酶对肝素（以及所采用的仪器）的敏感性有所不同，最近的一项研究表明，APTT试验与对照比在2.0~3.0时是治疗性肝素水平很好的目标范围[31]。一些实验室通过测定肝素抑制抗因子Xa能力来监测肝素水平。APTT试验对低分子量肝素（LMWH）不敏感。当需要监测LMWH时（例如肾功能不全、肥胖或怀孕患者），必须使用LMWH特异性的抗Xa检测。
APTT结果不准通常是因为试管内血量不足，高红细胞压积导致血浆与枸橼酸盐比例下降，标本送到实验室被延误，或者静脉输液或肝素污染等原因。
2.凝血酶原时间
凝血酶原时间（PT）对因子Ⅶ、Ⅴ、Ⅹ、Ⅱ和纤维蛋白原缺乏敏感[30]，因此它在肝功能评估和华法林治疗监测中有价值。这些因子的遗传性缺陷少见而自身抗体罕见。有些狼疮抗凝物可能会影响PT以及APTT。极少情况下，接触牛凝血酶将触发产生抗凝血酶和抗因子V抗体。国际标准化比值（INR）在华法林治疗控制的标准化中很有帮助。INR是患者PT与正常人平均PT比值的国际敏感指数（ISI）次方。商业凝血活酶已被校准并给予ISI值，它反映了试剂对华法林治疗血浆的敏感性。对于PT延长的未接受华法林的患者，使用INR可能会造成误导。PT易受到分析前的影响与前面APTT检测中所述相同。
3.活化凝血时间
活化凝血时间（ACT）用于心脏部位的手术和心脏导管插入操作。
4.凝血酶时间
由于低纤维蛋白原水平或存在肝素、副蛋白、异常纤维蛋白原或纤维蛋白（原）降解产物时，都可使凝血酶时间延长[30]。类似的分子也可使爬虫酶时间延长，但对肝素不敏感。
5.特定因子分析
特定因子分析是基于患者血浆在以PTT或PT为基础的分析中，能纠正特定因子缺乏血浆的凝血时间的能力（见第20章）。
6.优球蛋白溶解试验
优球蛋白是来自患者标本并用凝血酶凝固制备而成的血浆沉淀物，含有纤维蛋白原、纤溶酶原和纤溶酶原抑制物，大部分纤溶抑制物缺乏。然后测定凝块溶解所需的时间。由于优球蛋白缺乏纤溶抑制物，凝块溶解通常相当迅速（90~分钟之内）。溶解时间异常缩短出现在严重肝病等纤溶亢进状态，但也可能只是因为纤维蛋白原过少血块形成差所致。
7.D二聚体
用免疫法检测由凝血酶和因子ⅩⅢa作用后呈交联的纤维蛋白降解产物。其水平升高表明广泛的局部纤维蛋白形成（深部静脉血栓形成、肺栓塞、肺炎）或弥漫性血管内凝血。阳性值在局部血栓形成的预测中价值小；阴性检查（视检测灵敏度而定）在排除血栓中更有帮助[32]。阳性D二聚体水平也被用来预测首次血栓治疗后的复发[33]；不过，年龄和性别之类的因素也必须与D二聚体水平一起考虑[34]。
8.纤维蛋白原
检测纤维蛋白原的常规方法是基于凝血酶时间测定，但也可能使用化学或免疫学方法[30]。纤维蛋白原也可以根据评估凝血酶原时间测定中凝块的密度来估计。由于纤维蛋白原是一种急性期反应物，在炎症和恶性肿瘤患者中水平经常升高。水平降低见于弥漫性血管内凝血、噬血细胞综合征、肝病晚期、天冬酰胺酶治疗或罕见的遗传性条件。
9.出血时间
这是反映体内血小板的功能试验，在评估血小板计数正常而怀疑血小板功能障碍的患者中有参考意义，但由于方法缺陷较多而一般不作为筛查试验[30]。现已开发出可更可靠的用于血小板功能异常筛查的自动化体外仪器，如已被广泛使用的血小板功能分析仪PFA-（DadeBehring公司）[30]。
八、高凝状态的检查
1.抗凝血酶，蛋白C和蛋白S
这些蛋白的功能测定比抗原缺乏测定更为敏感。在这些因子中，其中一个杂合子遗传缺陷患，通常只有轻度减少（正常因子水平的下限以下），但却可能有显著的静脉血液高凝状态的风险（特别是抗凝血酶缺乏者）。获得性抗凝血酶缺乏见于弥散性血管内凝血、肝疾病、肝素治疗以及广泛性血栓形成。获得性蛋白C和S缺乏见于维生素K缺乏、华法林治疗以及广泛性血栓形成。游离蛋白S缺乏见于继发性炎症的C4b结合蛋白增加患者中。在急性静脉血栓栓塞的情况下不应该进行这些检查。
2.活化蛋白C抵抗
它基于APTT检测（APC-APTT）的主要异常与遗传多态性因子V莱顿突变相关。
3.狼疮抗凝物
这是获得性抗β2糖蛋白Ⅰ（一种与磷脂有高亲和力的蛋白）的抗体，与动脉和静脉血液高凝状态相关。另一方面，短暂性阳性结果也可见于部分健康人。对于血栓形成危险功能性检测（稀释罗素蝰蛇毒试验、血小板中和试验）可能比抗心磷脂抗体的血清学试验更加敏感（见第20和22章）。
4.凝血因子V莱顿及凝血酶原GA突变
这些突变的检测以DNA为基础的，因而不会受到已患急性静脉血栓栓塞时的影响。
图27-2血清蛋白电泳
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